《病毒和病毒成份的提纯剖析》

病毒和病毒成份的提纯剖析

第十四章病毒和病毒成份的提纯

一、病毒的提纯

（一）沉淀法

（二）层析法

（三）两相溶剂间分配系数法

（四）红细胞吸附法

（五）电泳法

（六）超速离心法

（七）超滤法

二、病毒蛋白亚单位的分离

三、病毒脂质的抽提

四、病毒糖类的抽提

一、病毒的提纯

所谓病毒提纯，就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——dna或rna的详细研究都需要高纯度的病毒样品。

病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定标准。

1.物理均一性

测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。

2.病毒滴度与蛋白含量的比例

测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。

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3.免疫学反应

免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。

4.结晶形成

病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。

病毒提纯的主要依据和条件有。（1）病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖，要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒，病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小dna病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。

（2）病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。（3）对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子，可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。

（一）沉淀法

主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇（peg）沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。

1.中性盐沉淀法

病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。

2.聚乙二醇沉淀法

聚乙二醇（peg）为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉的主要是分子量为2000～6000的peg。将peg配成50%左右的溶液，或直接将固体peg加于

235毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。tanncock（1985年）成功地用peg浓缩了禽脑脊髓炎病毒。

3.有机溶剂沉淀法

甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。

4.等电点沉淀法

病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。多数病毒的等电点在ph4.5～5.5之间，因此在ph3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意ph对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。

5.皂土法

girin（1989年）应用皂土在酸性条件下（ph4～4.5）吸附轮状病毒sa-11，再在碱性条件下（ph8.5），又使其洗脱下来，从而达到纯化目的。

6.鱼精蛋白沉淀法

鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/lnacl时，病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。

（二）层析法

病毒粒子表面携带特定的电荷群，因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂具有亲和性。利用吸附剂的层析法分为两种，一种是正吸附法，即依据病毒粒子表面所携带的电荷进行特异性吸附，然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收；另一种是负吸附法，即只吸附组织或宿主细胞成份等非病毒蛋白，而让病毒粒子通过。收集滤液后经差速离心沉淀法回收病毒。由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不同，因此对吸附剂的亲和性也有显著的差异。

2361.萄聚糖柱层析法

将初步浓缩的材料，通过葡聚糖g-150或g-200柱层析，然后用0.02～0.15mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.6）洗脱，分部收集，测定280nm波长处的od值，将含病毒的各部分相混合，再浓缩，透析之后，即可得到比较纯净的病毒，nagano（1989年）用sephacryls-1000柱层析纯化了鸡传染性支气管炎病毒。

2.凝胶层析法

①磷酸钙凝胶。这是病毒吸附层析法中较为常用的凝胶，由0.5mol/lcacl2和0.5mol/lna2hpo4溶液混合制备凝胶状沉淀物。在中性条件下生成的凝胶称为“brushite”，在碱性条件下生成的凝胶称为羟基磷灰石（hydroxypatite）。两者均用0.001mol/l磷酸盐缓冲液悬浮，置于4℃4～5天，使它充分沉淀后应用。

②氢氧化锌凝胶。是由7mol/l氨水与0.1mol/l醋酸锌溶液滴加混合（ph8.5）而制备的，在制备后数小时内较稳定，可作为吸附剂。newton和beris等将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合，使其形成复合体后沉淀，然后用0.08mol/ledta（ph8.5）解离病毒，获得较好的回收量。

③焦磷酸镁凝胶：是由0.1mol/l焦磷酸钠和0.1mol/lmol/mgcl2，以2：10（体积）比例在室温中缓慢滴加混合而获得的较稳定的焦磷酸镁凝胶。西村等将牛痘病毒悬液同此凝胶混合，使病毒吸附于凝胶，然后用0.1mol/l盐水洗2次，最后用0.3mol/l枸橼酸钠溶液解离病毒，将病毒较好地回收于水相中。

3.离子交换纤维素柱层析法

离子交换层析适于分离几乎所有带电荷的分子。通常有阴离子交换剂和阳离子交换剂两种。

某些病毒可以被离子交换剂经离子键作用而吸附，通过改变平衡液的离子强度，使其再洗脱下来而达到纯化目的。腺病毒和口蹄疫病毒被deae纤维素吸附，可分别再用0.5mol/l和0.15mol/lnacl溶液洗脱下来，从而得以纯化。

4.亲和层析法

亲和层析是一种特殊的吸附层析，基质与待分离物具有特异的生物亲和力。通常是将特异的抗体经共价偶联作用结合在配基上组成一种不溶性配基。当相应的抗原物质通过固定配基装成的层析柱时，即被吸附。随后再改变实验条件，将其洗脱下来，达到纯化的目的。该法是于80年代初期开始用于病毒的分离提纯，不仅纯度好，敏感，而且回收率高。

237njayou（1991年）应用此法成功地提纯了麻疹病毒。他们应用猴抗麻疹病毒的igg进行共价偶联，获得了高纯度而有活性的病毒，回收率可达总回收成份的30％。rimmelzwaan（1987年）应用犬细小病毒的中和性单克隆抗体亲和层析，纯化了细小病毒，经sds—page和elisa鉴定，99％以上的杂蛋白被洗除，收获了70～90％的病毒抗原成份。

（三）两相溶剂间分配系数法

该法主要原理就是高分子物质以溶质形式存在于两相溶剂中，根据其分配系数的不同而选择性地分配于其中的一方，从而达到纯化的目的。所采用的溶剂主要有：葡聚糖硫酸盐（dextransulphate，ds）和聚乙二醇（peg）或甲基纤维素（mc）和聚乙烯醇（pva），形成ds—peg系、ds—pva系和ds—mc系。利用病毒在有机溶剂中的分配原理，在适当的溶剂系统和葡聚糖层之间进行多次反复转换，不仅能够浓缩病毒，而且还可以纯化病毒。

通常是将两相溶剂如ds—peg以适当的重量百分比混合，然后加入病毒液，数次激烈振荡混合，置于4℃24～36小时，即可分离为两层，病毒将特异地分布于其中一方（如ds层中）。适当改变溶剂的混合比例时，分配于ds层中的病毒可由ds层转入peg中，而得以浓缩。若调节适当，一步就可浓缩100倍，两步浓缩就可以达到10000倍。

非病毒物质通常以不同的方式进行分配，从而达到浓缩纯化的目的。nammar（1991年）应用ds—pva系纯化了反转录病毒。两相溶剂间分配系数法简单、温和，并能使病毒得到较高的浓缩和纯化。但是为了获得高度纯化的病毒，还需配合应用其它方法。

（四）红细胞吸附法

所谓病毒的红细胞凝集反应，就是指病毒被红细胞表面粘蛋白吸附的现象。自hirst发现流感病毒的红细胞凝集性质以来，随后相继发现其它一些动物病毒也有红细胞凝集性。stanley证明，流感病毒在0℃时被红细胞吸附，而在37℃时却从红细胞上脱离下来的性质，从而将此方法应用于病毒提纯。

我们实验室应用醛化鸡红细胞吸附马流感病毒，取得较好效果。具体方法是：采取鸡血，以无菌生理盐水洗涤3次后制成压积红细胞。另取福尔马林和生理盐水等量混合，制成福尔马林盐水。在2份福尔马林盐水中加入1份压积红细胞，充分振荡15min，置2～8℃冰箱内48h，每天振荡2～3次。届时取出，再振荡1次，后用700r/min离心5～10min，弃上清，再加20倍量生理盐水，振荡混合后置2～8℃冰箱过夜。弃上清，加入20倍量生理盐水，如上洗涤3次。取沉淀红细胞，加入相当于初次压积红细胞量的生理盐水，混匀后即可应用。

将马流感病毒感染的鸡胚尿囊液，作2500r/min离心10min，吸取上清液。取保存于2～8℃的病毒液100ml，加入2～8℃的醛化红细胞悬液6ml，充分振荡15min，立即放入冰箱内每2h振荡1次，共2～3次，随后置冰箱中过夜，待其自然沉淀。次日吸出上清，

238如其血凝价在1。15以下，则证明已经充分吸附，此时即可进行释放，否则需再补加醛化红细胞悬液继续吸附。在已充分吸附病毒的醛化红细胞沉淀中，加入相当于原病毒液1/10量的5mol/lnacl溶液，充分振荡，置37℃水浴中4h，每隔30～60min振荡1次。取出后立即以700r/min离心10min。吸取上清液，即为浓缩病毒液，必要时可对已释放过病毒的醛化红细胞作第二次释放，方法同前。

上述吸附-释放方法，可将病毒浓度提高10倍左右（以血凝效价表示）。

（五）电泳法

先将病毒悬液对缓冲液透析。根据病毒的种类不同，选择适当的缓冲液，但离子强度不能超过0.3mol/l以上。病毒粒子依据其所携带的电荷，在电场中或向正极，或向负极移动，因此电泳结束后，分段收集病毒区带部分，就能达到提纯的目的。

作用。蛋白酶k在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理，它具有消化包围靶dna蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号.但蛋白酶k的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核的消失，从而影响杂交结果。edta缓冲液可以替代蛋白酶k的作用，解决上述出现的问题，并能达到理想的染色效果。

蛋白酶k的应用比较广泛，它可以消化包围靶dna蛋白，因此使用蛋白酶k能够增加探针与靶核酸结合的机会增强杂交信号，但在使用蛋白酶k时要主要使用的浓度，过高或者过低都会破坏细胞的结构、核消失等影响试验结果。

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